Question

禾谷镰刀菌可侵染小麦等作物，使其产量和品质下降。研究者通过构建融合基因 Ve-FG 并转化拟南芥，以期实现转基因植物抗禾谷镰刀菌的目的。

（1）利用 PCR 技术，将野生番茄的抗黄萎病基因 Ve 与禾谷镰刀菌的识别基因 FG 进行重组，构建融合基因 Ve-FG（如图 1）。

① 设计 3 对引物。其中引物 2 的一部分序列与 C 片段一部分序列互补，另一部分序列与_____片段一部分序列互补。

② 通过 PCR 分别克隆A、C、P 片段。克隆 A 片段应选用的引物是_____。

③ 以 A、C、P 片段为_____进行延伸，将 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 进行 PCR，扩增融合基因 Ve-FG。

（2）用_____将 Ve-FG 与质粒连接，构建重组质粒（如图 2，图中潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达）。将农杆菌与重组质粒混合，一段时间后涂布到含有_____的平板培养基上进行筛选。用含重组质粒的农杆菌转化拟南芥，几周后收获种子，种在含有潮霉素的培养基上，获得转基因拟南芥株系 1 和株系 2。

（3）分别提取株系 1 和 2、非转基因拟南芥植株叶片中的 DNA 作为模板，PCR 扩增 Ve-FG 基因后进行电泳，结果如图 3。

① 电泳时应以_____为阳性对照。

② 成功导入 Ve-FG 基因的是_____。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但电泳结果无阳性条带，原因可能是_____。

（4）为检验融合基因 Ve-FG 的功能，以导入 Ve-FG 基因的植株为实验组，导入空白质粒的植株为对照组，分别接种_____。一段时间后观察发现，与对照植株相比，实验组整体长势更旺盛，叶片萎蔫程度、叶片变黄程度也较轻，这表明_____。

Answer

P 1、3 模板 DNA连接酶 卡那霉素 融合基因 Ve-FG 株系 2 株系1中导入的是空白质粒，应空白质粒中也含有上述的两种抗性基因 禾谷镰刀菌 转基因拟南芥中的Ve-FG基因在拟南芥细胞中成功表达。

【解析】

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步。在循环之前，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。PCR过程为:变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

（1）① 设计 3 对引物。其中引物 2 的一部分序列与 C 片段一部分序列互补，另一部分序列与P片段一部分序列互补，才能实现图示的连接。

② 通过 PCR 分别克隆A、C、P 片段。选用的引物1、3可完成A 片段的克隆。

③ 以 A、C、P 片段为模板进行延伸，将 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 进行 PCR，扩增融合基因 Ve-FG。

（2）用DNA连接酶将 Ve-FG 与质粒连接，构建重组质粒（如图 2）。将农杆菌与重组质粒混合，由于 重组质粒中含有抗卡那霉素的基因和潮霉素抗性基因，但是潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达，因此，一段时间后将农杆菌涂布到含有卡那霉素的平板培养基上进行筛选，从而将经过转化的农杆菌筛选出来。用含重组质粒的农杆菌转化拟南芥，几周后收获种子，种在含有潮霉素的培养基上，从而将含有重组质粒的拟南芥株系 1 和株系 2筛选出来。

（3）分别提取株系 1 和 2、非转基因拟南芥植株叶片中的 DNA 作为模板，PCR 扩增 Ve-FG 基因后进行电泳，结果如图 3。

① 电泳时应以融合基因 Ve-FG为阳性对照。

② 成功导入 Ve-FG 基因的是株系2。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但电泳结果无阳性条带，原因可能是株系1导入的是空白质粒，从而不能急检测到目的基因。

（4）为检验融合基因 Ve-FG 的功能，以导入 Ve-FG 基因的植株为实验组，导入空白质粒的植株为对照组，分别接种禾谷镰刀菌。一段时间后观察发现，与对照植株相比，实验组整体长势更旺盛，叶片萎蔫程度、叶片变黄程度也较轻，这表明导入的Ve-FG基因在拟南芥细胞中成功表达。