Question

Sanger法DNA测序技术的核心原理：由于双脱氧核苷酸（ddNTP）的2＇和3＇都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以中断DNA分子合成反应。在四个含有4种脱氧核苷酸（dNTP）的DNA体外合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分别为：ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP），在PCR过程中复制随机终止，产生四组不同长度的一系列终止处带有标记的DNA片段。然后在变性凝胶（加入尿素等碱性物质）上进行电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列，具体过程见下图。

注：ddA是ddATP的缩写形式。

（1）上图Ⅰ过程横线①中应该加入的物质是_____________，dNTP中dATP与ATP在组成上的区别是_____________，为什么该过程中需要添加引物？_____________

（2）材料中提到“在变性凝胶上进行电泳…”，请解释“变性”_____________，为什么要变性处理？_____________

（3）如果电泳结果如图所示，请写出待测DNA分子的序列_____________。

（4）某同学要通过PCR技术获得被³²P标记且以碱基“C”为末端、不同长度的子链DNA片段，在反应管中已经有模板、引物、酶和相应缓冲液等等，还需加入哪些原料_____________。

Answer

耐高温的DNA聚合酶 dATP中五碳糖为脱氧核糖、ATP中五碳糖为核糖 DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段上 破坏DNA分子中的氢键，获得单链 避免模板链对结果的影响 dATP、dGTP、dTTP、dCTP、ddCTP

【解析】

PCR技术：

1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。

2、原理：DNA复制。

3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。

4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）

5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。

（1）图1过程Ⅰ横线①处加入的物质是催化脱氧核苷酸形成长链的Taq酶，所以是耐高温的DNA聚合酶；dATP中五碳糖为脱氧核糖、ATP中五碳糖为核糖；该过程需要添加引物的原因是DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸添加到已有核酸片段上。

（2）题干中“在变性凝胶上进行电泳……”中“变性”是指破坏DNA分子中氢键，获得单链，其目的是避免模板链对结果的影响（或使模板链与子链分离，使电泳结果直接反映子链的长度，便于读序）。

（3）根据电泳结果的先后顺序，写出DNA分子序列：。

（4）要通过PCR技术扩增的原料有dATP、dGTP、dTTP、dCTP，获得被32P标记且以碱基“C”为末端、不同长度的子链DNA片段还需要原料ddCTP，所以需要加入dATP、dGTP、dTTP、dCTP、ddCTP。