Question

玉米自交系（遗传稳定的育种材料）B具有高产、抗病等优良性状，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需依次进行步骤Ⅰ、Ⅱ试验。

Ⅰ、获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如图。

（1）为防止酶切产物____________________，构建基因表达载体需用2种限制酶。

（2）下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知，细胞脱分化时使用的激素是__________，自交系__________的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。

激素 结果 自交系	2，4-D（2.0mg/L）	6-BA（0.5mg/L）	IBA（2.0mg/L）
愈伤组织形成率（%）	芽的分化率（%）	根的诱导率（%）
甲	99	13	90
乙	85	80	87
丙	88	83	12
丁	16	85	83

（3）农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织，需使用含____________________的选择培养基。

（4）转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织，出现蓝色的是____________________和_________________________。

（5）组织培养获得的转基因植株（核DNA中仅插入一个G基因）进行自交，在子代含G基因的植株中，纯合子占__________。继续筛选，最终选育出抗除草剂纯合自交系A。

Ⅱ．通过回交使自交系B获得抗除草剂性状

（6）抗除草剂自交系A（GG）与自交系B杂交产生F₁，然后进行多轮回交（下图）。自交系B作为亲本多次回交的目的是使后代积累越来越多______________________。

 

（7）假设子代生活力一致，上图育种过程H₃代中含G基因植株的比例是__________，若回交后每代不进行鉴定筛选，直接回交，H₃代中含G基因植株的比例是__________。

（8）下表是鉴定含G基因植株的4种方法。请预测同一后代群体中，4种方法检出的含G基因植株的比例最小的是__________。

方法	检测对象	检测目标	检出的含G基因植株的比例
PCR扩增	基因组DNA	G基因	x1
分子杂交	总mRNA	G基因转录产物	x2
抗原-抗体杂交	总蛋白质	G基因编码的蛋白质	x3
喷洒除草剂	幼苗	抗除草剂幼苗	x4

（9）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

 

①第__________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

②在PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________________________。

 

（10）对H_n继续筛选，最终选育出高产、抗病、抗除草剂等优良性状的玉米自交系。

Answer

自身环化 2，4-D 乙 除草剂 含有目的基因的愈伤组织（转化愈伤组织） 附着农杆菌的转化愈伤组织 1/3 使后代积累越来越多自交系B的遗传物质（优良性状） 1/2 1/8 X4 3 DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

Ⅰ、（1）如果用一种限制酶来切割目的基因两端和质粒时，目的基因两端会出现相同的末端。这样在构建基因表达载体时，会出现3种情况：目的基因-目的基因、目的基因-运载体、运载体-运载体，这样会出现自身环化现象，因此为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶。
（2）高度分化的植物细胞脱分化可产生愈伤组织，据表中信息可知：细胞脱分化时使用的激素是2，4-D。比较甲乙丙丁4种自交体系，发现自交系乙芽的分化率、根的诱导率都较高，因此自交系乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。
（3）实验最终想使玉米自交系（遗传稳定的育种材料）B为获得抗除草剂性状，可以使用含除草剂的选择培养基，筛选转化的愈伤组织，如果能存活，说明获取具有抗除草剂的性状的愈伤组织。
（4）转化愈伤组织有含有内含子的报告基因，可产生该基因表达产物，能催化无色物质K呈现蓝色，即K处理该愈伤组织能呈现蓝色；农杆菌附着的转化愈伤组织能在选择性培养基上正常生长，并含有含有内含子的报告基因，能产生能催化无色物质K呈现蓝色的物质，故K处理该愈伤组织能呈现蓝色。
（5）转基因植株（核DNA中仅插入一个G基因）的基因型为G-，进行自交，子代的基因型及比例为1/4GG、2/4G-、1/4--，其中含G基因的植株（14GG、24G-）中，纯合子占1/4÷3/4＝1/3。
Ⅱ、（6）根据图示可知，自交系B作为亲本多次回交的目的是使后代积累越来越多自交系B的遗传物质/优良性状。
（7）抗除草剂自交系A（GG）与自交系B（G-G-）杂交产生F1（GG-），F1（GG-）回交，即与B（G-G-）杂交，后代为GG-和G-G-，比例为1：1．①若回交后每代进行鉴定筛选，则H1‘为GG-。因此育种过程F1、H1、H2、H3各代中含G基因植株的比例分1、1/2、1/2、1/2、之后一直是1/2。若回交后每代不进行鉴定筛选，直接回交，即GG-和G-G-都与B（G-G-）杂交，则后代中含G基因植株的比例为1/4。因此育种过程F1、H1、H2、H3各代中含G基因植株的比例1/2、1/4、1/8…1/2n。即H3代中含G基因植株的比例是1/8。
（8）根据表格中信息可知：PCR扩增技术可以在体外大量增殖目的基因，故x1含量最多；但已导入到受体细胞中的目的基因不一定完成转录，因此x2＜x1；已导入到受体细胞中目的基因虽然完成转录，但不一定能完成翻译产生相应的蛋白质，故x3＜x2；构建基因表达载体和将目的基因导入受体细胞的概率较小，故x4＜x3，显然比例最小的是x4
（9）①由图示可知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链。
②在PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。