Question

回答有关乳腺生物反应器问题。

Ⅰ．人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：

（1）htPA基因与载体用同种__________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用_______________________技术。

（2）为获取更多的卵（母）细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其__________。采集的精子需要经过__________，才具备受精能力。

（3）将重组表达载体导入受精卵常用的方法是__________。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行____________。移植后对受体母羊还需进行____________的检查。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的____________。

（4）若在转ht-PA基因母羊的羊乳中检测到____________，说明目的基因成功表达。

Ⅱ．科研人员采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子IX医用蛋白，其技术路线如图。

（1）由过程①获得的A为________________________。

（2）在核移植之前，必须先去掉受体卵母细胞的核，目的是___________________。受体应选用____________期卵母细胞。

（3）进行胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生____________，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。

（4）采用胎儿成纤维细胞进行转基因体细胞克隆，理论上可获得无限个转基因绵羊，这是因为______________________________。

Answer

限制酶（限制性核酸内切酶） DNA分子杂交技术 超数排卵 或能处理 显微注射法性 性别鉴定 是否妊娠 全能性 人组织纤溶酶原激活物（htPA） 含目的基因的表达载体 保证核遗传物质来自含目的基因的成纤维细胞 MⅡ 免疫排斥反应 整合有目的基因的成纤维细胞可进行传代培养

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
胚胎移植的生理基础
（1）供体与受体相同的生理变化，为供体的胚胎植入受体提供了相同的生理环境；
（2）胚胎在早期母体中处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能；
（3）子宫不对外来胚胎发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能；
（4）胚胎遗传性状不受受体任何影响。

Ⅰ．（1）htPA基因可以直接从人体细胞中获取，并通过技术PCR大量扩增。htPA基因与载体用限制酶切割后，再通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用DNA分子杂交（或核酸探针）技术。
（2）为获取更多的卵（母）细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其超数排卵。采集的精子需要经过获能处理，才具备受精能力。通常采用的体外获能方法有培养法和化学诱导法。
（3）将重组表达载体导入羊受精卵常用的方法是显微注射法。为了获得转基因母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行性别鉴定。移植后还要对受体母羊进行是否妊娠的检查。还可对所获得的胚胎进行胚胎分割可获得多个转基因个体，这说明早期胚胎细胞具有全能性。（4）若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到htPA（或人组织纤溶酶原激活物），说明目的基因成功表达。显示达到了我们预期的目的。
Ⅱ．（1）要想目的基因只在乳腺组织中表达，在构建基因表达载体时，需要将人的血清白蛋白基因和乳腺组织特异性表达的启动子等调控组建重组在一起，过程①获得的A为含目的基因的表达载体。
（2）在核移植之前，必须先去掉受体卵细胞的核，目的是保证核遗传物质来自含目的基因的成纤维细胞，核移植的受体应选用处于MⅡ中期的卵母细胞，以便重组细胞全能性的发挥。
（3）进行胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。胚胎移植时，一般选择发育良好的桑椹胚或囊胚。
（3）因为整合有目的基因的成纤维细胞可进行传代培养，因此采用胎儿成纤维进行转基因体细胞克隆，理论上可获得无限个转基因绵羊。