Question

图是从大肠杆菌细胞中分离的质粒结构的示意图，利用质粒构建基因表达载体，可生产人胰岛素用于临床治疗。请回答下列问题：

 

（1）人胰岛素基因不能从基因组文库中提取，而一般在DNA文库或用人工合成的方法获得，因为人胰岛素基因含有不编码蛋白质的__________，在原核细胞中不能表达。

（2）构建重组质粒时，应用两种__________对目的基因、质粒进行切割，形成特定的黏性末端，防止目的基因自身环化、空载质粒形成、__________，以提高构建重组质粒的效率。

（3）图中启动子是__________识别和结合的DNA片段。

（4）已知胰岛素是由A链、B链组成的蛋白质类激素，利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素时，先让β-半乳糖苷酶基因与胰岛素基因融合表达使胰岛素的蛋白酶作用位点被保护起来，再通过化学方法连接A链和B链，从而得到有功能的胰岛素。请简要说明这样做的原因：__________。

Answer

内含子 限制酶 目的基因反向连接到质粒中 RNA聚合酶 胰岛素A链和B链在大肠杆菌细胞中会被蛋白酶分解或工程菌细胞没有众多的细胞器，不能对胰岛素（原）进行加工

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）从基因组文库中获得的胰岛素基因有内含子，在大肠杆菌中胰岛素基因的转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素。因此人胰岛素基因不能从基因组文库中提取，而一般在DNA文库或用人工合成的方法获得。
（2）在构建该基因表达载体时，需用两种限制酶处理目的基因和质粒，形成特定的黏性末端，能防止目的基因自身环化、空载质粒形成、目的基因反向连接到质粒中，以提高构建重组质粒的效率。
（3）图中启动子是RNA聚合酶识别和结合的DNA片段，是转录发生的起点。
（4）已知胰岛素是蛋白质类激素，利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素时，先让β-半乳糖苷酶基因与胰岛素基因融合表达使胰岛素的蛋白酶作用位点被保护起来，再通过化学方法连接A链和B链，从而得到有功能的胰岛素。显然这样做的目的是避免胰岛素A链和B链在大肠杆菌细胞中被蛋白酶分解。