Question

自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。

（1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用__________的培养基进行分离，这种培养

基属于__________培养基（按功能分类）。可在培养基中加入__________指示剂鉴别该类微生物。

（2）若取土样7g，应加入__________mL的无菌水配制成稀释10 倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成10¹～10⁷不同浓度的土壤溶液。将10³～10⁷倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为__________。将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中__________倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为__________。

稀释倍数	10^3	10^4	10^5	10^6	10^7
菌落数（个）	1号平板	478	367	277	26	5
2号平板	496	354	261	20	8
2号平板	509	332	260	29	3

（3）这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目___（低/高），原因是__________。

（4）若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过__________灭菌（无菌技术），在第二次及以后划线时，总是从上一次的未端开始划线。这样做的目的是__________。

Answer

尿素作为唯一的氮源 选择 酚红 63 稀释涂布平板法 105 1．33×108 低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续的）单菌落

【解析】

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：
（1）分离菌株的思路：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
（2）实验室中目的菌株的筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度。pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物
统计菌落数目的方法（1）稀释涂布平板法（间接）①当样品的稀释庋足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。②通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。（2）利用显微镜直接计数3．分解尿素的细菌的鉴定细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
实验流程土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定。

（1）以尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用尿素作为唯一氮源的培养基就能够选择出分解尿素的微生物，这种培养基属于选择培养基培养基。分解尿素的细菌的鉴定细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
（2）若取土样7g，应加入63mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为稀释涂布平板法。在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30～300的进行记数，求其平均值，显然105倍条件下的菌落数比较合适。由此计算出每克土壤中的菌落数=（277+261+260）÷3÷0.2×105=1.33×108个/mL。
（3）由于一个菌落可能是由一个或多个细菌繁殖而来，因此用稀释涂布平板法测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。
（4）平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做是将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落。