Question

将正确的基因导入细胞以替代错误的突变基因是目前基因治疗的一种重要形式；也可借助基因编辑技术直接修复错误的基因进行基因治疗。请回答下列相关问题：

（1）将正确的基因导入细胞，其核心是构建____________________。下图为进行这一核心过程的案例，该过程中需选择____________________限制酶进行酶切。

（2）如果仅已知目的基因首尾两端的部分核苷酸序列，通常可根据该基因首尾两端的已知脱氧核苷酸序列设计并合成__________，利用__________技术得到大量目的基因。

（3）为鉴定上图所示3种连接方式形成的载体，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对其进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析。若出现7300bp和200bp的两种条带，则所鉴定的是__________载体；若出现__________，则所鉴定的是载体自连载体。

（4）CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑：根据目的基因的部分序列设计向导RNA，向导RNA与目的基因结合后，就会引导Cas9蛋白结合于目的基因的特异性位点并进行切割，从而介导基因添加、基因删除、基因校正等。向导RNA与目的基因的结合遵循__________原则，Cas9是一种__________酶。

Answer

基因表达载体 XhoⅠ 引物 PCR 反向连接 7000bp的一种条带 碱基互补配对 限制

【解析】

基因工程的操作步骤有：目的基因的获取、基因表达载体的构建、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。

（1）基因工程的核心是构建基因表达载体。由图可知，目的基因和质粒均有XhoⅠ的识别序列，故应该用该酶进行切割。

（2）常根据已知脱氧核苷酸的一段已知序列设计合成引物，通过PCR技术进行扩增。

（3）目的基因的长度为500bp，质粒的长度为7000bp，若为载体自连，则只有HpaⅠ酶的识别序列，无BamHⅠ酶的识别序列，用二者切割后，只能打开一个切口，只有一种条带，长度为7000bp；若为正向连接，则重组质粒的总长度为7500bp，含有HpaⅠ酶和BamHⅠ酶的识别序列各一个，同时用这两种酶切割后，会产生2种条带，分别为500bp、7000bp；若为反向连接，则重组质粒的总长度为7500bp，含有HpaⅠ酶和BamHⅠ酶的识别序列各一个，同时用这两种酶切割后，会产生2种条带，分别为200bp、7300bp。

（4）向导RNA与目的基因之间遵循碱基的互补配对原则，Cas9可以切割目的基因，故为限制酶。