Question

乳头瘤病毒（HPV，为DNA病毒）可导致人患宫颈癌，科研人员将HPV某外壳蛋白A基因构建成表达载体，经包装或直接注入体内，表达出相应抗原，诱导机体产生免疫反应。该方法获得的疫苗称为DNA疫苗。请回答下列问题：

（1）获取A基因的方法：

①方法一：提取HPV的DNA，利用PCR技术扩增A基因。PCR技术的前提是：____________，以便合成引物。PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但___________的引物需要设定更高的退火温度。如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____（填序号：①升高退火温度  ②降低退火温度  ③重新设计引物）。

②方法二：从宿主细胞中提取总RNA，以与__________________互补的一段单链DNA作为引物，加入___________酶获得cDNA，然后经PCR扩增获得大量的A基因。

（2）在基因工程的基本操作程序中，利用PCR技术扩增目的基因后，需要进行_____________，其目的是__________。该过程中常用不同的限制酶切割质粒与目的基因，其具备的优势是___________________。

Answer

①要有一段已知目的基因的核苷酸序列 引物与模板 GC含量高 ②③ A基因转录出的mRNA 逆转录（反转录） 构建基因表达载体 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用 避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接

【解析】

获得目的基因的方法：
①从基因文库中获取：②利用PCR技术扩增：③人工合成：这种方法有两条途径，一是以目的基因转录的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，再在酶的作用下合成双链DNA，即目的基因；另一条途径是蛋白质的氨基酸序列，推测出信使RNA序列，再推测出结构基因的核苷酸序列，然后用化学的方法以单核苷酸为原料合成。
PCR条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。

（1）获取A基因的方法：

①方法一：提取HPV的DNA，利用PCR技术扩增A基因。首先要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，如长度相同但GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。如果PCR反应得不到任何扩增产物，则需要降低退火温度和重新设计引物以便该过程的顺利进行。

②方法二：从宿主细胞中提取总RNA，以与A基因转录出的mRNA互补的一段单链DNA作为引物，加入逆转录酶获得cDNA，然后经PCR扩增获得大量的A基因。

（2）在基因工程的基本操作程序中，利用PCR技术扩增目的基因后，构建目的基因表达载体，这样能使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。在构建目的基因表达载体时常用不同的限制酶切割质粒与目的基因，这样能避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接。