Question

水蛭素是一种小分子蛋白质，其对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现的最强凝血酶天然特异抑制剂。通过基因工程技术生产水蛭素的方法如下图所示。请据图回答：

（1）过程①需要的原料是__________，过程③必需的酶有__________，过程④为提高导入效率，常用__________溶液处理大肠杆菌。

（2）过程②中可通过__________技术大量扩增水蛭素基因，被扩增的水蛭素基因必须有一段核苷酸序列是已知的，以便根据这一序列合成__________。 

（3）水蛭素基因不含质粒图谱中限制酶识别序列。为使水蛭素基因重组进该质粒，水蛭素基因两端需分别加入不同限制酶__________和__________的识别序列。

（4）在导入重组质粒后，过程⑤为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加__________的培养基进行培养。

Answer

脱氧核苷酸(dNTP或dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 限制酶和DNA连接酶 CaCl2 PCR 引物 AscⅠ BamHⅠ 卡那霉素

【解析】

基因工程操作的四个步骤为：1、获取目的基因2、构建基因表达载体3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测和表达。获得目的基因的方法：①从基因文库中获取②利用PCR技术扩增③人工合成(化学合成)。限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．

（1）①是通过反转录法形成cDNA的过程，此过程需要的原料是脱氧核苷酸(dNTP或dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。③是构建重组表达载体的过程，需要用限制酶切割质粒与目的基因，同时需要用DNA连接酶把目的基因与质粒连在一起，过程④为提高导入效率，常用CaCl2溶液处理大肠杆菌。

（2）过程②中可通过PCR技术大量扩增水蛭素基因，被扩增的水蛭素基因必须有一段核苷酸序列是已知的，以便根据这一序列合成引物。 

（3）为使水蛭素基因重组进该质粒，需要用与质粒图谱中相同的识别序列的限制酶切割水蛭素基因，而图中的限制酶pvuI可破坏卡那霉素抗性基因，限制酶BssSI破环复制原点，限制酶XbaI破坏启动子，限制酶SalI破环终止子，因此为使水蛭素基因重组进该质粒，水蛭素基因两端需分别加入不同限制酶AscⅠ和BamHⅠ的识别序列。

（4）在导入重组质粒后，过程⑤为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加卡那霉素的培养基进行培养。