Question

如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindDI在质粒上 的识别位点如乙图所示。

（1）通过PCR技术扩增目的基因需使用引物，引物的作用是_________。若已经合成了甲图所示4种引物，应选择引物_____扩增目的 基因。若由一条甲图所示的DNA扩增目的基因，PCR过程完成4轮循环，理论上至少 需加入引物___________个。

（2）过程①是_________，该过程中应使用限制酶_________切割质粒。不使用另外两种限制酶切割质粒的原因是_________。

（3）②过程需用_________处理大肠杆菌使其处于感受态并完成转化过程，对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行_________处理，以防其污染环境。

Answer

定位目的基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点 1和4 30 基因表达载体的构建 BamHⅠ 若使用ECORⅠ切割质粒会将目的基因插入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用BamHⅢ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选 Ca2+（CaCl2） 灭菌

【解析】

1．基因表达载体由启动子、终止子、标记基因和目的基因组成。
2．基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
3．限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键．基因工程中常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
4．选择限制酶需注意插入目的基因时不能破坏标记基因；PCR扩增基因时，两种引物结合的部位相反，延伸的方向相反；限制酶具有特异性，不同的限制酶识别不同的序列，判断某种限制酶能否切割片断，应该据该片段中是否含有限制酶的识别序列。

（1）在PCR技术中所需要的引物实质上是一种单链DNA或RNA分子，引物的作用是定位目的基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点。若已经合成了甲图所示4种引物，应选择引物1和4扩增目的 基因。若由一条甲图所示的DNA扩增目的基因，PCR过程完成4轮循环，理论上至少 需加入引物30个。

（2）过程①是基因表达载体的构建，该过程中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒。不使用另外两种限制酶切割质粒的原因是若使用ECORⅠ切割质粒会将目的基因插入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用BamHⅢ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选。

（3）②过程需用CaCl2处理大肠杆菌使其处于感受态并完成转化过程，对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境。