Question

多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果胶使细胞壁破损。番茄果实成熟过程中PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程的方法减少PG基因的表达，可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入到番茄细胞中，得到转基因番茄。请据图回答：

（1）基因工程的核心是_____________。若已获取PG的mRNA，可通过__________法获取PG基因。在该基因上游添加结构A可确保基因的反向转录，结构A上应具有_______________的识别和结合位点。

（2）构建PG反义质粒的过程中需要用到的工具酶有_____________、________________。

（3）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有______________的培养基进行筛选，培养24～48h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞______________现象来鉴别细胞壁是否再生。培养再生植株过程依据的原理是________________。

（4）导入的目的基因能转录反义RNA，且能与________________互补结合，抑制PG基因的正常表达。若转基因番茄的保质期比非转基因番茄________，则可确定转基因番茄成功。

（5）获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因，科研人员常采用_____________方法使子代保持转基因番茄的优良性状。若想培育出一种地上结番茄，地下长马铃薯的植株，可以利用__________技术。

Answer

基因表达载体的构建 反转录 RNA聚合酶 限制酶 DNA 连接酶 （顺序可颠倒） 卡那霉素 是否发生质壁分离 植物细胞的全能性 天然PG基因转录的mRNA 长 无性繁殖（或植物组织培养） 植物体细胞杂交

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）基因工程的核心是基因表达载体的构建。若已获取PG的mRNA，可通过逆转录法获取PG基因。在该基因上游添加结构A可确保基因的反向转录，结构A是启动子，其上应具RNA聚合酶的识别和结合位点，从而保证了PG基因反向转录的正常进行。

（2）构建PG反义质粒的过程中需要用到的工具酶有DNA连接酶和限制酶。能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是酚类化合物。

（3）由图可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有卡那霉素的培养基进行筛选。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，培养24～48h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞是否发生质壁分离现象来鉴别细胞壁是否再生。利用转基因成功的细胞培养再生植株过程的理论基础是植物细胞的全能性。

（4）由于导入的目的基因能转录反义RNA，且能与天然PG基因转录的mRNA互补结合，进而抑制PG基因的正常表达。由于减少PG基因的表达，可延长果实保质期，因此若转基因番茄成功，则转基因番茄的保质期比非转基因番茄长。

（5）获得的转基因番茄相当于杂合子，杂合子不能稳定遗传，因此其产生的种子不一定保留目的基因，但可采用无性繁殖（或植物组织培养）方法使子代保持转基因番茄的优良性状。若利用植物体细胞杂交技术可以培育出一种地上结番茄，地下长马铃薯的植株，该方法能克服远缘杂交不亲和的障碍，获得杂种植株。