Question

人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t- PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。(注：下图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。)

请回答下列问题：

（1）以上制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为____________工程。

（2）已知人t-PA基因序列已测出，且第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的模板链碱基序列为AGA，因此要获得改造后的目的基因最好采用 _____________法获得。

（3）若t-PA改良基因的黏性末端如图所示，那么需选用限制酶XmaI和 _________切开质粒pCLY11，才能与t PA改良基因高效连接。在基因工程中，最核心的一步为_______________________。

（4）一般选择在未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，目的是_____。在加入新霉索的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，原因是_____________，这时需选择呈_____________色的菌落，进步培养 、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。

Answer

蛋白质 化学合成 BglⅡ 基因表达载体的构建 以便筛选出导入质粒pCLY11的大肠杆菌 导入未连目的基因的质粒的大肠杆菌也可以在这种培养基上生长 白

【解析】

蛋白质工程是指根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。目的基因的获取可以从基因文库中提取，可以使用PCR进行扩增获得。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

（1）在原有的t-PA蛋白基础上改良蛋白质结构，属于蛋白质工程；

（2）由于t-PA蛋白基因的序列已知，因此可以使用化学合成的方法获得目的基因；

（3）目的基因的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知所使用的限制酶为XmaI和BglⅡ，要想把目的基因与运载体拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此运载体也需要XmaI和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建；

（4）选择未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，这些细胞没有新霉素的抗性，当其导入重组质粒后，质粒上的标记基因使得大肠杆菌具有新霉素抗性，这样可以选择导入质粒pCLY11的大肠杆菌；由于标记基因存在于原有质粒上，若未连目的基因的质粒导入到大肠杆菌中，这些大肠杆菌也可以获得新霉素的抗性；而区分重组质粒和原有质粒的一个标志可以观察mlacZ基因的表达情况，由于重组质粒拼接了目的基因，破坏了mlacZ基因，因此在重组质粒中该基因不表达，菌落呈现白色，而原有基因由于该基因保存完整，可以表达，所以菌落呈现蓝色。