Question

图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有氨苄青霉素抗性基因（amp'）和四环素抗性基因（tet'）。请回答下列问题：

 

（1）EcoRV酶切位点为…CTA↑TAG…，EcoR V酶切出来的线性载体P1为_________未端。

（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端分别带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸，两端添加不同的核苷酸的主要目的是____________________。载体P1用酶处理，在两端分别添加了碱基为_________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在_________酶作用下，形成重组质粒P3。

（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“－”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是_________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_________、_________。

菌落类型 平板类型	A	B	C
无抗生素	+	+	+
氨苄青霉素	+	-	-
四环素	+	-	+
氨苄青霉素+四环素	+	-	-

（4）为检测目的基因是否正常表达，可采用_________方法进行鉴定。

Answer

平 使目的基因能定向插入表达载体，减少自连 胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C） DNA连接酶 C A类菌落含有PO B类菌落未转入质粒 抗原-抗体杂交

【解析】

基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，且切割位点位于两条链中间T与A之间，因此其切出来的线性载体P1为平末端。

（2）在目的基因两端添加不同的核苷酸的主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，减少自连。目的基因片段的两端分别带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则可知，则载体P1用酶处理，在两端分别添加了碱基为胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的脱氧核苷酸，形成P2；将目的基因与运载体连接需要采用DNA连接酶。

（3）由图可知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长，不能在含有四环素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择C类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。

（4）检测目的基因是否表达应该采用抗原-抗体杂交法。