Question

金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如图，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______获得______用于PCR扩增。

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______位点。设计引物时需要避免引物之间形成______，而造成引物自连。

（3）图中步骤1代表______，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。若要将1个目的基因复制10 次，则需要在缓冲液中至少加入______个引物。 从理论上推测，第四轮产物中含有引物1的DNA片段所占的比例为______。

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏______的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但______的引物需要设定更高的退火温度。

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有______（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）．

Answer

逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 变性 211-2 15/16 引物与模板 GC含量高 ②③

【解析】

本题考查PCR技术的相关知识，要求学生在熟记基础知识的前提下，熟练运用知识解题。

（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，用于PCR扩增。

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物，为方便构建重组质粒，在引物中需加入适当的限制性核酸内切酶位点。设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，从而造成引物自连。

（3）图中步骤1的条件是94℃的高温处理，故代表变性；PCR 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n+1-2。因此，若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入211-2个引物。第四轮循环即DNA复制4次，共形成16个DNA，其中2个DNA含有引物A或引物B，14个DNA含有引物A和引物B，含有引物1的DNA片段占15/16。

（4）PCR扩增时，退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但GC含量高（GC含量越高，稳定性越大）的引物需要设定更高的退火温度。

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有②降低退火温度、③重新设计引物。