Question

【生物——选修1:生物技术实践】某兴趣小组采用稀释涂布平板法对牛奶样品中的微生物进行计数，步骤如下。回答下列问题:

（1）梯度稀释：每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是____________。

（2）涂布平板：取O.lmL稀释液，选用下图中的____________均匀地涂布在牛肉膏蛋白腺固体培养基表面，每个浓度下涂布三个平板。为避免杂菌污染，接种应在_____________________附近进行。可用____________的培养基作为空白对照以检验培养基配制是否达标。

（3）培养与计数：将上述平板放入恒温培养箱中培养，每隔12小时统计一次菌落数，取菌落数稳定时的记录作为结果，防止______________。在10⁴、10⁵、10⁶倍稀释时的统计结果记录如下表：

   计算得每毫升牛奶样品中细菌数大约是___________个。这种方法统计的活菌数往往比实际数目低，原因是___________。除此以外，___________也是测定微生物数量的常用方法，此方法需要使用血细胞计数板。

Answer

使微生物和无菌水混合均匀 B （酒精灯）火焰 未接种 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 5×l07 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 显微镜直接计数

【解析】试题分析：本题考查微生物的计数的有关知识，意在考查考生对知识的识记、理解和运用能力。

（1）每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。

（2）稀释涂布平板法在涂布平板是需要用到涂布器。图中B是涂布器，所以用C滴管取O.lmL稀释液后，需要选择B涂布器均匀地涂布在牛肉膏蛋白腺固体培养基表面。为避免杂菌污染，接种应在（酒精灯）火焰附近进行。为检验培养基配制是否达标要用未接种的培养基作为空白对照。

（3）统计菌落数量时，应取菌落数稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。一般选择菌落数在30-300的平板进行计数，因此要选择稀释倍数为倍且培养时间为48h的统计结果进行计数，每毫升牛奶样品中细菌数大约是×=5×个。这种方法统计的活菌数往往比实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。除此以外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法，此方法需要使用血细胞计数板。

【点睛】知识点拨：

一、常用的微生物接种方法有两种

a．平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

系列稀释操作(如下图所示)：

涂布平板操作(如下图所示)：

二、消毒和灭菌的辨析

项目

条件

结果

常用方法

应用范围

消

毒

较为温和的物理或化学方法

仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物

煮沸消毒法

日常用品

巴氏消毒法

不耐高温的液体

化学药剂消毒法

用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源

灭

菌

强烈的理化因素

杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

灼烧灭菌法

接种工具

干热灭菌法

玻璃器皿、

金属工具

高压蒸汽

灭菌法

培养基及容

器的灭菌

三、稀释涂布平板法计数微生物的注意问题

用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。解题时易出现以下误【解析】

(1)只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶发因素的影响。

(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：

①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”之间，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。

②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。

可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。